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Strukturuntersuchungen mittels PELDOR

Strukturuntersuchung an großen Proteinen mittels PELDOR –
Eine gepulste Elektronenspinresonanz Technik, die Untersuchungen am ganzen Protein in Lösung ermöglicht.

 


phytochromePhytochrome sind Rotlicht-absorbierende Photorezeptoren, die in Abhängigkeit von Licht eine Vielzahl an Prozessen - wie z.B. die Ergrünung von Pflanzenteilen - in Pflanzen, Algen, Pilzen, Bakterien und Cyanobakterien regulieren. Es handelt sich um stark konservierte Proteine, die aus zwei homologen Untereinheiten bestehen. Der N-Terminus bildet jeweils die photosensorischen Domäne (PCM*) mit einem Chromophor, der C-Terminus jeweils die regulatorischen Domäne mit einer Histidinkinase zur Phosphorylierung von Proteine. Die Anordnung der Untereinheiten zueinander ist dabei noch ungeklärt.  Das Phytochrom ändert lichtinduziert und reversibel seine Konformation von der Pr-Form (absorbiert hellrotes Licht) zur Pfr-Form (absorbiert dunkelrotes Licht). Dabei isomerisiert eine Doppelbindung im Bilin-Chromophor des PCM. Dies zieht eine Konformationsänderung über die gesamte Länge des Proteins nach sich und moduliert so die Aktivität der Histidinkinase am N-Terminus.

Trotz vieler struktureller Daten ist der Mechanismus der Konformationsänderung  im gesamten Protein weitgehend unbekannt, da die Röntgenstrukturanalyse oder die hochauflösende NMR-Spektroskopie bei so großen Proteinen – die meisten Phytochrome sind zwischen 85 und 120 kDa groß  –  an ihre Grenzen stoßen.

WissenschaftlerInnen der Forschungsgruppe von Prof. Dr. Stefan Weber vom Institut für Physikalische Chemie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg konnten erstmalig die lichtinduzierten Konformationsänderungen an einem ganzen Phytochrom (Phytochrom Agp1 aus Agrobacterium fabrum C58) in Lösung untersuchen. Dies konnte mittels PELDOR** erreicht werden, eine gepulster Elektronenspinresonanz Technik, die es ermöglicht ganze Proteine jeglicher Größe in Lösung zu untersuchen und die Abstände zwischen jeweils zwei paramagnetischen Zentren im Protein im Bereich von ca. 1,5 bis 8 nm zu bestimmen.

Zunächst führten WissenschaftlerInnen der Forschungsgruppe von Prof. Dr. Tillman Lamparter vom Institut für Botanik vom Karlsruher Institut für Technologie (KIT) paramagnetische Spin-Sonden im Phytochrom ein und erzeugten so sieben für PELDOR Messungen geeignete Mutanten. Diese enthalten jeweils eine Spin-Sonde pro Untereinheit in verschiedenen Regionen des Proteins. Die Signalübermittlung vom PCM zur Histidinkinase bewirkt strukturelle Änderungen in beiden homologen Untereinheiten und  so sollten sich diese auch in Änderungen im Abstand der Untereinheiten zueinander zeigen.  Mittels PELDOR wurde eine Kartierung der Abstände der Untereinheiten zueinander erhalten. Dabei wurden dunkeladaptierte Proben (Pr-Form) und mit Rotlicht beleuchtete Proben (Pfr-Form) untersucht.

Die PELDOR Messungen zeigen folgendes: Die Anordnung der PCM Domäne weicht im ganzen Protein in Lösung signifikant von der Anordnung in der Röntgenstrukturanalyse ab. Die Anordnung der Hisitidinkinase-Domäne hingegen stimmt gut überein.  Aus den PELDOR Daten konnte auf eine parallele Anordnung der Untereinheiten im Phytochrom Agp1 geschlossen werden. Es konnte allerdings weder in der sensorischen noch in der regulatorischen Domäne eine signifikante lichtinduzierte Änderung im Abstand der Untereinheiten nachgewiesen werden. Somit muss davon ausgegangen werden, dass die Signalübermittlung im Protein nicht mit Konformationsänderungen einhergeht, die eine Änderung im Abstand der Untereinheiten bewirken, bzw. dass die Abstandänderungen zu gering sind, um mit PELDOR gemessen werden zu können (also kleiner als 1,5 nm).

Originalveröffentlichung:

S. Kacprzak, I. Njimona, A. Renz, J. Feng, E. Reijerse, W. Lubitz, N. Krauss, P. Scheerer, S. Nagano, T. Lamparter, S. Weber
Intersubunit distances in full-length, dimeric, bacterial phytochrome Agp1, as measured by pulsed electron-electron double resonance (PELDOR) between different spin label positions, remain unchanged upon photoconversion
Journal of Biological Chemistry 292 (2017) 7598–7606

http://www.jbc.org/lookup/doi/10.1074/jbc.M116.761882


Kontakt:
Prof.  Dr. Stefan Weber
Magnetische Resonanz - Institut für Physikalische Chemie - Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
Tel.: 0761/203-6214
E-Mail: stefan.weber@physchem.uni-freiburg.de
 

*PCM = photosensory core module
**PELDOR = Pulsed Electron-Electron Double Resonance

 

 

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